Petrolle Kirlenmiş Toprağın Biyodegradasyon Potansiyelinin Belirlenmesi İçin Etkili Moleküler Yaklaşımının Geliştirilmesi

Abstract

PETROLLE KİRLENMİŞ TOPRAĞIN BİYODEGRADASYON POTANSİYELİNİN BELİRLENMESİ İÇİN ETKİLİ MOLEKÜLER YAKLAŞIMININ GELİŞTİRİLMESİ ÖZET Yenilenebilir enerji üretimindeki artışa rağmen, petrol ürünleri hala sanayi ve yerel tüketim için enerjinin ana kaynağıdır. Dünyanın yıllık ham petrol üretim miktarı üç milyar tondan daha fazladır. En çok petrol tüketen ülkeler en büyük petrol üreticileri arasında olmadıklarından, üretilen petrolün büyük miktarı boru hattı ve su yolları vasıtasıyla aktarılmaktadır. Büyük miktarda petrolün arama, çıkarılma, üretim, taşıma, rafinaj ve depolama faaliyetleri esnasında çevreye girişim yapmaktadır. Petrol atıkları, sağlık sorunlarına ve insan hayatı ve ekosistemin düzenini bozmaya sebep olan toksik, mutajenik ve kanserojen bileşikler, içerir. Bu maddelerin çevreye bırakılması ilgili mevzuata göre kısıtlanmıştır. Petrol çamuru su, yağ emülsiyonu, metal, katran ve çok sayıda petrol hidrokarbon bileşiği içerir ve karmaşık bir yapıya sahiptir. Petrol çamurlarının yanlış bertarafı ciddi toprak, su ve yeraltı suyu kirliliğine neden olmaktadır. Toprak buhar ekstraksiyonu, toprak yıkama ve dispersiyon gibi bazı fizikokimyasal yöntemler yaygın olarak petrolle kirlenmiş ortamların ıslahı için kullanılmaktadır, fakat, bu yöntemler petrol kirliliğini tamamen bertaraf edemiyor aynı zamanda kirlenmiş bölgelerin toksikliğini artırabilir. Biyoremediasyon, ekonomik ve çevre dostu bir arıtma metodu olarak bu sorunları ortadan kaldırmaktadır. Bu işlem sırasında kirletici bileşikleri toksik olmayan materyallere dönüştürülür veya tamamen CO2 ve H2O'ya dönüşür. Biyoremediasyon uygulanan alanlarda yerli mikroorganizmalar veya aşılanmış olarak kullanılanları, oksijen veya başka bir ekleyici kullanılarak organik kirleticilerin metabolize olması için canlandırılabilir. Bioaugmentasyon, iyileştirilmiş biyoremediasyon tipi olarak, mikrobiyal suşların eklenmesiyle biyoremediasyon alanının biyolojik bozunma potansiyelinin gelişmesidir. Bu işlem çeşitli kirletici maddelerin indirgenmesinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, genetik mühendisliği mikroorganizmalar kullanımı ile ilgili endişeler ve bu mikroorganizmaların çevre üzerindeki muhtemel etkileri yaygın olmaktadır. Biyostimülasyon, biyoaugmentasyon'a alternatif olarak ve sürdürülebilir bir biyoıslah yöntemi olarak biyoaugmentasyon'a göre toprak biyoremediasyonunda daha etkili bir yöntemdir. Kirlenmiş ortamda bu işlemin verimliliğin izlenmesi ve biyolojik bozunma durumunun değerlendirilmesi, biyostimülasyon uygulamasında önemli adımlardan biridir. Etkili bir izleme biyoremidasyon maliyetini ve ıslah süresini azaltabilir. Petrolle kirlenmiş toprakların biyoremediasyon işleminin değerlendirilmesi ve biyolojik bozunma potansiyelinin belirlenmesi için etkili bir moleküler izleme yaklaşımının geliştirilmesi bu tezin misyonudur. Ayrıca, biyoıslah işlemi sırasında mikrobiyal topluluğun yapısının ve fonksiyonel gen dinamiğinin değerlendirilmesi de, bu tezin bir misyonudur. Aerobik mikrokozmaları testi kurularak, biyostimülasyon sürecinde biyolojik bozunma durumu, mikrobiyal topluluğun yapısı, ve fonksiyonel gen dinamiği değerlendirilmiştir. Aynı zamanda mikrobiyal topluluğun içinde fonksiyonel genlerin horizontal geçiş oluşumu analiz edilmiştir. Bu amacı gerçekleştirmek için, petrolle kirlenmiş toprak örnekleri petrol depolama lagününden toplandı ve karakterize edildi. Alınan örneklerde dominant bakteri türleri Illumina Sekanslama yöntemini kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen petrolle kirlenmiş örnekler temiz orman toprağı örnekleri ile karıştırılıp farklı oranlarda ve ağırlıklarda cam kaplara konuldu. Elde edilen toprak karışımlarına farklı oranlarda N:P ekleyerek 90 gün boyunca 24 ° C'de yetiştirildi. Genomik DNA, toplam RNA, ve plazmidler çıkartıldı. Genomik DNA, toplam RNA, ve plazmidler ekstre edildi. TaqMan probu ile kantitatif gerçek zamanlı PCR alkan ve poli aromatik hidrokarbonlar (PAH) degrade eden bakteriler, alkB, phnAc ve nah fonksiyonel genlerin ölçülmesi için kullanılmıştır. Bir son-arıtma yöntemi olarak Trametes versicolor ve Bjerkandera adusta fungus türleri kullanarak biyostimülasyon uygulaması ardından biyoaugmentasyon uygulandı. Söz konusu fungusların yerli mikrobiyal topluluğuna ve alkB, phnAc ve nah fonksiyonel genlere etkisi, 29 ºC'de 60 günlük bir sürede biyoaugmentasyon uygulanarak değerlendirildi. Biyodegradasyon testi boyunca, maksimum biyodegradasyon miktarı C:N:P oranı, 100:15:1'e ayarlanan mikrokozmoslardan elde edildi. En çok toplam organik karbon (TOK) giderim miktarı 18% ve başlangıç TOK miktarı 15% olan mikrokozmoslara ait idi. Petrolle kirlenmiş topraktan toplanan örneklerin mikrobiyal analizleri, gram-negatif bakterilerinin dominant bakteriyal grup olduklarını gösterdi: γ-proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes ve δ-proteobacteria dominant bakteri filumları oldukları belirlendi. Bu bakteri grupları, belirlenmiş bakteriyel suşların %65’inden fazlasını kapsamakta oldukları açıklandı. Biyostimülasyon bir sürdürülebilir biyoremediasyon yaklaşımı olarak, petrolle kirlenmiş toprağın biyodegradasyonun artırılabilmesi için yapılan biyodegradasyon testiyle açıkça ortaya koymuştur. Yapılan petrolle kirletilmiş toprağın biyostimülasyon sürecinde yerli mikrobiyal topluluğun miktari analizleri gram-negatif bakterilerin gram-pozitif bakteriler üzerinde bir rekabet avantajı olduğunu gösterdi. Petrolle kirlenmiş toprak örnekleri ve deneysel aşamada elde edilen örneklerde söz konusu bakteri grubunun dominant olması, kirlenmiş bölgedeki petrol hidrokarbonlarına uzun vadeli bir ortama alıştırma sürecinden dolayı bu bakteriler biyodegradasyon setlerindeki temiz orman toprağından alınan örneklerden kaynaklanan diğer yerli bakterilerin üstesinden gelebilmelerini gösteriyor. Bu bakterilerin istikrarında herhangi bir başarısızlık, alkan ve PAH biyodegradasyon işleminde bir düşüşe yol açacaktır. alkB ve phnAc genlerin başarılı horizontal geçişi tespit edildi. Biyostimülasyon işlemi sırasında horizontal gen geçişi (HGÇ) oluşumunun tespit edilmesi, HGÇ biyoremidasyon sürecinin izlenmesi için yararlı bir biyolojik gösterge olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kirli alanlarda HGÇ değerlendirilmesi biyoremidasyon potansiyelinin daha geniş bir şekilde tahmin edilmesini sunabilir ve petrolle kirlenmiş bölgede HGÇ oluşumu hakkında olumlu işaretlerin elde edilmesi, biyostimülasyon işleminin kirlenmiş bölgenin biyoremediasyonu için uygun bir yaklaşım olduğunu teşhir etmektedir. Son-arıtım fazından elde edilen sonuçlar, T. versicolor and B. adusta fungusları biyostimülasyon fazdan kalan petrol kalıntılarını önemli miktarda indirgeyemediklerini gösterdi. Ancak qPCR sonuçlarına göre T. versicolor, petrol kalıntılarının biyodegradasyonunda B. adusta'dan daha etkilidir. Son-arıtım fazı aşamasında, alkB, phnAc ve nah fonksiyonel genlerin ekspresyon miktarı sinerjik olarak artırılmıştır. Aktif bakteriyel hücreler, negatif gram ve gram-pozitif bakter miktarında kayda değer bir değişiklik gözlemlenmemiştir. İlerideki çalışmalarda, anaerobik mikroorganizmaların toksik bileşenlerin bozunması işleminde daha verimli olduklarından biyoremediasyon çalışmalarında kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca, farklı anaerobik fungus türlerinin kombinasyonları ve anaerobik fungus ve bakteri türlerinin birleşimleri petrolle kirlenmiş toprakların maksimum biyodegradasyonu için önerilmektedir. Aynı zamanda, biyoaugmentasyon sürecinde inokulum mikroorganizmalar ve yerli olanlar arasındaki fonksiyonel genlerin horizontal geçişi, verimli bir biyomarker olarak biyoremediasyon yaklaşımının izlenmesi için test edilebilir.

DEVELOPMENT OF EFFECTIVE MOLECULAR APPROACH FOR DETERMINING OF THE BIODEGRADATION POTENTIAL OF PETROLEUM CONTAMINATED SOIL SUMMARY Despite an increase in the production of renewable energy, petroleum products are still the main source of energy for industry and domestic consumption. World production of crude oil is more than three billion tons per year. Because of the fact that most of petroleum consumer counties are not major oil producers, huge amount of produced oil is transferred via pipeline and water ways. Vast amount of petroleum enters to the environment through exploration, extraction, production, transportation, refining and storage activities. Petroleum wastes involve toxic, mutagenic and carcinogenic compounds which cause health problems and disorders to human life and ecosystems. The release of these materials to the environment is restricted with regulations. Petroleum sludge has a complicated structure including water, oil emulsion, metals, tars and numerous petroleum hydrocarbon compounds. Improper disposal of oily sludge leads to serious soil, water and groundwater pollutions. Some physicochemical methods such as soil vapor extraction, soil washing and dispersion are common methods for treatment of petroleum polluted sites and remediation of oil sludge, however, these methods are not able to complete decompose petroleum pollution and may lead to increase the toxicity of contaminated sites. Bioremediation as a cost-effective and environmental friendly method overcomes these problems. During this process pollutant compounds are converted to nontoxic materials or completely degraded to CO2 and H2O. Indigenous microorganisms or inoculated ones in the bioremediation sites can be stimulated to metabolize organic pollutants using nutrients, oxygen, or other amendments. Bioaugmentation as an enhanced bioremediation type refers to improvement of the biodegradation potential of bioremediation site by adding of microbial strains. This process has remarkable effect on the degradation of various contaminants. However, concerns about using of genetically engineered microorganisms and their probable impacts on the environment are commonly raised. Biostimulation as an alternative for bioaugmentation and as a sustainable bioremediation method represents a more efficient method of soil bioremediation than bioaugmentation. Monitoring of the efficiency of this process and the evaluation of the biodegradation manner in the contaminated site is one of the important steps in biostimulation practice. An effective monitoring could reduce the bioremediation cost and treatment duration. Development of an effective molecular monitoring approach for evaluation of the biostimulation process and biodegradation potential of petroleum contaminated soil was the mission of this thesis. The evaluation of the microbial community structure and functional gene dynamics during the biostimulation process was also the mission of this thesis. Setting up aerobic microcosms test, the biodegradation manner during biostimulation process, microbial community structure and functional gene dynamics were evaluated. The occurrence of horizontal transfer of functional genes within microbial community was also analyzed. For this purpose, petroleum contaminated soil samples were collected from petroleum storage pit and characterized. Dominant bacterial species of collected samples were determined using Illumina sequencing. Obtained petroleum polluted samples were mixed with clean forest soil samples in different ratios and weighted in glass vessels. Obtained mixtures were amended with different N:P ratios and cultivated at 24 ºC for 90 days. Genomic DNA, total RNA, and plasmids were extracted. Quantitative real time PCR with TaqMan probe was used for the quantifying of alkane and poly aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading bacteria and alkB, phnAc and nah functional genes. As a post-treatment method treated contaminated soil was bioaugmented with Trametes versicolor and Bjerkandera adusta fungi following the biostimulation practice. The effects of mentioned fungi on the indigenous microbial community and, phnAc and nah functional genes through 60 days bioaugmentation practice at 29 ºC were evaluated. Throughout the biodegradation test, maximum biodegradation rate was obtained when C:N:P ratio was arranged to 100:15:1. The most total organic carbon (TOC) removal rate was 18% and obtained from setup with initial TOC amount of 15%. Microbial analysis of collected petroleum polluted soil samples showed that gram-negative bacteria were dominant bacterial group. γ-proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes and δ-proteobacteria were dominant bacterial phyla. These bacterial groups covered more than 65% of the determined bacterial strains. Biodegradation examination clearly revealed that biostimulation as a sustainable bioremediation approach enhances the biodegradation of petroleum contaminated soil. Quantitative analysis of indigenous microbial community in the biostimulation process showed that gram-negative bacteria have a competitive advantage over gram-positive bacteria in studied petroleum polluted soil. Dominance of this bacterial group in the petroleum contaminated soil samples and samples obtained from experimental phase demonstrates that due to a long term acclimation to the petroleum hydrocarbons in the polluted region these bacteria could overcome other indigenous bacteria of the biodegradation vessels which were originated from clean forest soil. Any failure in stability of these bacterial will lead to a decrease in alkanes and PAHs biodegradation process. A successful horizontal transfer of alkB and phnAc functional genes was detected. Detection of the occurrence of horizontal gene transfer (HGT) phenomenon during the biostimulation process shows that, HGT can be used a helpful biomarker for monitoring of bioremediation process. Furthermore, evaluation of HGT in a contaminated site can present the broader estimation of bioremediation potential of contaminated site and positive signs about the occurrence of HGT in a petroleum-contaminated site will indicate that biostimulation is a suitable choice for bioremediation of the contaminated site. Results obtained from the post-treatment phase showed that T. versicolor and B.adusta fungi cannot fully biodegrade the petroleum residues remained from biostimulation phase. However, based on the qPCR results T. versicolor is effective than B. adusta in biodegradation of the petroleum residues. During post-treatment phase, the expression level of alkB, phnAc and nah functional genes were increased synergistically. Any significant change in the amounts of active bacterial cells, gram-negative and gram-positive bacteria were observed. For further studies bioremediation studies using anaerobic microorganism because of their efficiency in the biodegradation of toxic compounds is recommended. Combination of different strains of anaerobic fungi and combination of anaerobic fungi and bacteria for maximum biodegradation of petroleum contaminated soil are also suggested. Horizontal transfer of functional genes between inoculated microorganisms and indigenous ones during bioaugmentation process can also be tested as an efficient biomarker for monitoring of this enhanced bioremediation approach.